Родился в Нижнем Новгороде, в семье рабочих.
В 1941 году окончил семилетку и пошёл работать электромонтёром.

Год проучился в дизелестроительном техникуме, четыре года работал слесарем на заводе «Красная Этна».
Занимался в самодеятельности, играл джаз.

Был очень музыкален, виртуозно играл на разных инструментах: гитаре, рояле, вилках. 
В 1946 году был зачислен на первый курс Горьковского театрального училища (ныне Нижегородское театральное училище им. Е.А. Евстигнеева).

Окончив его в 1951 году, был распределён во Владимирский областной драматический театр им. А.В. Луначарского.
В 1954 году поступил в Школу-студию им. В.И. Немировича-Данченко при МХАТ СССР им. М. Горького в Москве, сразу на второй курс.

В середине 1955 года студенты Школы-студии МХАТ, среди которых был и Евгений, создали «Студию молодых актёров», которая через год стала базой для нового столичного театра «Современник».

В 1956 году окончил Школу-студию МХАТ (курс П.В. Массальского) и был принят во МХАТ.
С 1957 года - актёр театра «Современник».

Первую свою значительную роль в театре сыграл в 1960 году в спектакле «Голый король» по пьесе Е.Л. Шварца. 
В 1971 году перешёл в труппу МХАТа. 
Снялся более чем в ста лентах в кино и на телевидении.

Самые запоминающиеся роли были в фильмах: «Добро пожаловать, или Посторонним вход воспрещён» (1964), «Берегись автомобиля» (1966), «Золотой телёнок» (1968), «Старики-разбойники» (1971), «Семнадцать мгновений весны» (1973), «Невероятные приключения итальянцев в России» (1973), «Место встречи изменить нельзя» (1979), «Старый новый год» (1980), «Зимний вечер в Гаграх» (1985), «Собачье сердце» (1988). 
В 1976-1985 годах вёл педагогическую работу в Школе-студии МХАТ, с 1977 года - профессор.

Также преподавал на Высших курсах сценаристов и режиссёров.
Заслуженный артист РСФСР (21.02.1968). Народный артист РСФСР (30.05.1974). Народный артист СССР (23.02.1983).
Лауреат Государственной премии СССР  - за исполнение роли Петра Хромова в спектакле «Сталевары» Г.К. Бокарева (1974).
Лауреат Государственной премии РСФСР им. братьев Васильевых - за телевизионный фильм «Собачье сердце» (1990).
Лауреат премии "Хрустальная Турандот" (1992).
Скончался в одной из клиник Лондона накануне операции на сердце.
Похоронен в Москве на Новодевичьем кладбище.
Награды: ордена Ленина (1986); Трудового Красного Знамени (1982).
Память: Нижегородское театральное училище носит имя Евстигнеева (6.10.2003). На здании училища установлена памятная доска (Нижний Новгород, Нижегородский район, улица Варварская, 3/а).
В Нижнем Новгороде возле Нижегородского академического театра драмы (улица Большая Покровская, 13) установлена скульптура актёра (2006).
Установлена памятная доска на улице Бакунина в Канавинском районе Нижнего Новгорода, где актёр прожил первые 8 лет жизни (09.10.2014, бывший "Посёлок Володарского").

Также памятная доска установлена на здании заводоуправления ОАО «Этна» (бывший завод «Красная Этна») - улица Порт-Артурская, 1 (Ленинский район, Нижний Новгород).
В сентябре 2017 года постановлением Городской Думы Нижнего Новгорода было принято решение о переименовании Театральной площади (Нижегородский район) в площадь Евстигнеева.